IPS诱导肠类器官的培养过程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、以及类器官的培养。本文将重点介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制：

(1) 在2-8℃温度下解冻hPSC Medium Supplement，融化后轻轻摇动以确保均匀混合，分装后立即使用或储存于-20~-80℃，以避免反复冻融。

(2) 将10mL的hPSC Medium Supplement按1:50的比例加入500mL的hPSC Medium Basal Medium中，混合均匀即成为人多能干细胞培养基（abs9403）。注意：配制后的人多能干细胞培养基可在2-8℃稳定储存2-3周，但不建议使用超过3周的培养基。

(3) 实验试剂应进行温度平衡：人多能干细胞培养基在室温避光下平衡，PBS和消化液等于37℃加热。注意：培养基中的因子不应在37℃水浴中加热。

二、操作方法

以下步骤需在无菌条件下进行：

hPSC细胞复苏：

1. 实验操作步骤：

（1）基质胶包被培养板：取出6孔板/12孔板，每孔加入1mL/0.5mL基质胶（abs9410），轻轻摇动使基质胶完全覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1-2小时。使用前置于超净工作台/生物安全柜中平衡20分钟。如暂时不使用，可用Parafilm封口后在2-8℃储存，并于一周内使用。

注意：每支冻存的干细胞数量约为1×10⁶ cells/mL，适用于6孔板每孔；即用型基质胶温度敏感，应使用后立即存回4℃冰箱，并避免用手触碰基质胶瓶身。

（2）准备2-3mL的干细胞培养基于15mL离心管中备用。

（3）解冻：将冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1-2分钟内完全解冻。注意：减少细胞在室温中的暴露时间。

（4）离心：解冻后的冻存液逐滴加入含干细胞培养基的15mL离心管中，置于低速离心机中平衡后，以1000rpm离心3分钟。

（5）重悬：离心后弃去上清，加入1mL人多能干细胞培养基，用吹吸法混匀，吹吸3-5次。

（6）接种：在已处理好的基质胶中，添加均匀的干细胞悬液至6孔板，每孔补充2mL培养体系。

（7）培养：将接种后的6孔板在倒置相差显微镜下观察干细胞的密度及团块大小，确保每个团块至少有4个细胞，并轻轻摇动使细胞均匀分布，置于37℃、5% CO₂恒温培养箱中培养，第二天观察细胞的贴壁情况。

（8）换液：从复苏开始，每24小时更换一次新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）细胞传代：

2. 实验具体操作步骤：

（1）清洗：吸掉原有培养基，慢慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿皿边缘吸去PBS缓冲液。

（2）消化：在6孔板中加入2mL人多能干细胞消化液（abs9409），置于37℃培养箱中2-5分钟，根据细胞的生长密度可以调整消化时间。

（3）吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，轻柔吹打培养皿底3-5次，使细胞脱落，并转移至15mL离心管中。

（4）离心：以1000rpm离心3分钟，弃去上清。

（5）接种：用干细胞培养基轻轻吹打细胞5-10次，吸掉包被培养板中的基质胶，然后将细胞悬液加入培养板中，补充每孔2mL的培养体系。

（6）换液：传代后每24小时更换新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）细胞冻存：

3. 实验具体操作步骤：

（1）清洗：同上。

（2）消化：同上。

（3）吹打：同上。

（4）离心：同上。

（5）重悬：加入2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412）对干细胞沉淀进行吹吸混匀，并转移至冻存管中。

（6）记录：在冻存管上标记细胞种类、时间、操作者及细胞批次。

（7）-80℃冰箱冻存：冻存管应直立放置在-80℃冰箱中，避免斜放或横放。

（8）液氮冻存：24小时后，将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中进行长期冻存。

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