二、TOPO克隆PCR产物的纯化回收：
1. PCR反应后，产物需通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以判断是否存在目的大小的条带；
2. 推荐采用切胶回收的方式进行纯化（切胶时间最好控制在3分钟内，以避免紫外照射对DNA的损伤），使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，浓度应≥30ng/μl，并再次跑胶确认仅存在目的条带。
3. 目的片段连接至载体：
- 连接反应体系应按照说明书要求进行，各组分投入体积应≥1μl；若浓度过高可适当稀释。
- 连接反应温度可设置为25°C或37°C，反应时间可从5分钟加长至30分钟，以获得最佳克隆效果，而避免克隆空载体或假阳性结果。
4. 感受态转化涂板：
- 转化时，推荐使用DH5α或Fast-T1等克隆用化学感受态细胞；
- 感受态细胞不应反复冻融，建议取出后一次性使用；
- 重组产物与感受态细胞的体积比例为1:10，推荐加入10μl重组产物至100μl感受态细胞，或者5μl重组产物至50μl感受态细胞；
- 热激时间应根据感受态细胞说明书进行操作；
- 使用平板抗生素需与转化载体坚持一致；
- 涂板时，将菌液离心（2500×g，3min），移取100μl重悬液涂板，或取适量体积进行涂布。
5. 单克隆菌落PCR鉴定：
- 从平板中挑选体积适中、大小合适的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落；
- 挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析；
- 将挑取的菌落放入含10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中溶解均匀，吸取1-2μl作为PCR反应模板（10/20μl反应体系）；
- 推荐使用上下游引物分别位于片段和载体进行PCR鉴定。

关于模板中存在Amp/kana抗性的质粒：建议对目的片段进行切胶回收。
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